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云南红豆杉叶斑病病原菌的分离鉴定和生物学特性

发布日期:[2019-9-13] 共阅:[499]次
云南红豆杉(TaxusyunnanensisChengetLu)别称紫杉、赤柏松,属红豆杉科乔木,产于云南西北部及西部、四川西南部与西藏东部,是生产紫杉醇的主要树种[1-3]。云南红豆杉是集用材、药用、绿化于一体的珍贵树种,特别是其紫杉醇含量远远高于其他红豆杉树种[4]。紫杉醇具有抗癌活性,云南红豆杉的野生资源比较少,人工培育红豆杉是目前获取紫杉醇最可行、有效的途径[1,5]。为了更好地保护野生云南红豆杉野生资源,大力培育后续产业,以满足市场对云南红豆杉资源的需求,近年来在云南丽江、大理、楚雄和丘北等地建立了云南红豆杉人工种植林。由于云南红豆杉的广泛栽培,病害发生严重,尤其是云南红豆杉叶片叶斑病现象日趋普遍,影响了树势生长及药用、观赏价值。分离与鉴定病原菌是开展云南红豆杉抗病防治研究的基础。本试验从自然感病的云南红豆杉上分离纯化得到1株对云南红豆杉具有寄生作用的真菌,利用传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合的方法,对云南红豆杉叶斑病病原菌进行了鉴定,并依据其形态特点与培养性状进行了初步研究,为云南红豆杉叶斑病的防治奠定了基础,同时也为进一步了解该病害的发病规律提供了一定的理论依据。
  1材料与方法
  1.1病原菌的分离
  云南红豆杉叶斑病叶片采自云南省楚雄市西山,用组织分离法分离病原菌,经科赫氏法鉴定其为云南红豆杉叶斑病的病原,菌株编号为hongdoushan02。
  1.2病原菌的鉴定
  1.2.1形态学鉴定利用显微镜观察纯化分离到的病原菌,并对其进行形态鉴定。
  1.2.2病原菌rDNA-ITS序列扩增和分析用CTAB法提取病原菌全基因组DNA,进行ITS-PCR扩增。引物序列为ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′;ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反应体系总体积25μL,反应各成分终浓度为:Taq酶0.02U/μL、引物0.4μmol/L、DNA模板20ng/μL、dNTPs0.4μmol/L、2×PCR反应缓冲液。PCR扩增程序为:95℃预变性3min;94℃变性30s,52℃退火45s,72℃复性45s,30个循环;72℃延伸10min。扩增产物送北京百泰克生物技术有限公司测序,所得序列在NCBI上比对,下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列,用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1软件采用NJ法进行系统分析,构建系统进化树。
  1.3生物学特性研究[6-7]
  1.3.1不同碳源和氮源对菌落生长的影响
  以察氏培养基为基础培养基,分别以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源;分别以硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每种培养基中分别接种直径为5mm的菌块,25℃恒温黑暗培养,5d后用“十”字交叉法测量菌落直径。每个处理设3个重复。
  1.3.2不同温度对菌落和分生孢子萌发的影响
  取直径为5mm的菌块接种于察氏培养基中央,分别在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45℃黑暗下恒温培养,5d后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液,滴于载玻片上,培养条件同菌落培养,24h后镜检孢子萌发率,每次检100个孢子。每个处理设3个重复。



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